Le Blog d'AREMANE

Vingt-cinq chercheurs, médecins et étudiants participent à l’ activité du laboratoire.
L’ objectif administratif pour notre laboratoire, était d’ être inséré dans l’ effectif des laboratoires agréés par l’ INSERM.
Cela sera chose faite au premier janvier 2005 . Ceci est un « plus » pour la reconnaissance du laboratoire en tant qu’ unité de recherche dans le domaine médical.

Quelques nouveautés concernant les personnes figurant à l’organigramme du laboratoire:
- La nomination d’André MULLER, (également vice-Président de l’ Association) en qualité de Professeur des Universités - Praticien Hospitalier
- Un chercheur INSERM a été intégré à l’équipe du laboratoire
- Deux chercheurs ont obtenu leur Habilitation à Diriger des Recherches (HDR)
- Trois bourses de thèse ont été attribuées
- Une bourse attribuée pour un « post doctorant ».
Enfin il faut noter que le docteur Luc DUPUIS a obtenu un prix de thèse, récompensant la qualité de ses travaux dans le domaine de la Sclérose Latérale Amyptrophique (SLA).

Ceci met en valeur la qualité des membres de l’ équipe du labo ; je les félicite et m’ en félicite.




L’ INFORMATION ET LA DIFFUSION DES CONNAISSANCES

Le travail d’ une équipe de chercheurs se vérifie notoirement par, les publications scientifiques qui paraissent dans les revues scientifiques spécialisées et par les brevets déposés.
Au cours des dix-huit derniers mois, le laboratoire EA 3433 a publié plus d’ une quinzaine d’ articles concernant les résultats des travaux de recherche effectués .
Autre moyen d’ information de la communauté scientifique :l’ organisation et la participation à des congrès.
Au cours des 12 derniers mois le Laboratoire a été co-organisateur de 2 congrès l’ un concernant la SLA en mai 2004 à Strasbourg, l’ autre portait sur la maladie d’ Alzheimer à Bâle en décembre 2003.
Chacune de ces manifestations a réuni entre 50 et 80 chercheurs. AREMANE figurait parmi les organismes participant à la préparation de ces manifestations.

De même, avec le soutien d’ AREMANE, le laboratoire est co-organisateur d’ un congrès de 4 jours qui se tiendra au printemps 2005 en Uruguay. Une cinquantaine de chercheurs, les plus représentatifs dans le domaine des recherches concernant la SLA, seront présents.
D’ores et déjà une revue scientifique spécialisée (Neurodegenerative disease) a accepté de publier un numéro spécial des communications qui seront faites à l’ occasion de ce congrès.
40 000 Euros sont à trouver pour l’ organisation de cette manifestation.

Plus près de nous, en juin dernier, à l’ attention du grand public, le quotidien régional « Les Dernières Nouvelles d’ Alsace » m’ a interviewé. Le thème de cet entretien concernait une orientation nouvelle des recherches conduites sur les origines de la SLA.

Voilà ce que je souhaitais dire concernant l’ information que celle-ci soit destinée à la communauté scientifique ou au grand public.


LA RECHERCHE ET LA VALORISATION DES CONNAISSANCES
Dans l’ année écoulée le laboratoire a déposé 2 brevets.

Une particularité de notre laboratoire à laquelle nous sommes particulièrement attachés est l’ importance que nous donnons à la synergie qui doit exister entre recherche fondamentale et recherche clinique.

Ainsi, en ce qui concerne la recherche clinique nous travaillons en permanence avec des unités spécialisées du CHU de Strasbourg et le centre de neurobiologie de La Pitié Salpêtrière à Paris.

Les 2 brevets que nous avons déposés récemment, concernent l’ un le diagnostic de la SLA l’autre la recherche de cibles thérapeutiques.
Jusqu’ à présent tous les essais thérapeutiques conduits par les entreprises pharmaceutiques ont échoué. Les travaux de notre laboratoire ont permis de partir sur des pistes nouvelles qui seront exploitées dans les années à venir.
Ces recherches coûtent cher mais rencontrent l’ intérêt des financeurs, en particulier locaux ( Biovalley par exemple dans la zone du Rhin moyen).
Pour aller plus loin dans la concrétisation clinique de ces travaux de recherche, des partenariats visant la valorisation sont prévus avec l’ INSERM et l’ Université Louis Pasteur de Strasbourg.

Si à propos de la SLA on peut espérer des avancées dans les années à venir, il n’ en est pas de même en ce qui concerne la maladie d’ ALZHEIMER.
L’ état de la situation est critique. Le nombre des malades ne cesse de progresser (actuellement plus de 800.000 en France) et la maladie reste incurable.
L’ objectif du laboratoire est de s’impliquer plus fortement dans ce domaine de recherche en collaboration avec les praticiens hospitaliers.
A l’image des travaux déjà effectués sur la SLA, les objectifs visent en premier lieu à développer des outils diagnostiques. Dans ce contexte AREMANE soutient activement la mise en place de réseaux avec d’ autres associations et la recherche de financeurs publics et privés.

Si besoin en était, ce qui vient d’ être dit montre que l’ esprit dans lequel nous travaillons c’est tout simplement, d’ avoir en permanence le souci du malade.


J.P. LOEFFLER

ETUDE DES MECANISMES
NEURODEGENERATIFS
DANS LA MALADIE D’ALZHEIMER (MA)


A) Protéine Précurseur du peptide b-Amyloïde (APP)
La MA est une affection caractérisée au plan anatomopathologique par la présence de dépôts de substance amyloïde, par une dégénérescence neurofibrillaire (DNF), et par une perte de neurones (Selkoe et al., 1988). Le peptide b-amyloïde (Ab), principal constituant des dépôts, semble avoir un rôle prépondérant dans la mort neuronale. Ce peptide est issu d’une protéine précurseur (Protéine Précurseur du peptide b-Amyloïde ou APP), et diverses mutations dans le gène de l’APP sous-tendent les formes familiales de MA. Si les altérations du métabolisme de la protéine Ab participent à la progression de la MA, l’APP peut par elle-même opérer comme une protéine trans-membranaire de transduction.
Les observations de plusieurs laboratoires, dont le notre, révèlent que la liaison d’un anticorps dirigé contre le segment extracellulaire de l’APP est suffisante pour provoquer la mort neuronale. Les mécanismes qui gouvernent ces évènements restent cependant à préciser. Deux stratégies sont mises en œuvre à cette fin :
- d’une part, l’analyse des voies de transduction connues dans la signalisation dépendante de l’APP. Dans cette logique seront étudiés en détail les rôles de deux familles de gènes impliqués dans la survie et/ou la mort neuronale, à savoir celle de p53 et celle des enzymes d’acétylation/désacétylation. Cette approche sera plus longuement exposée dans le chapitre suivant.
- d’autre part, l’analyse globale du transcriptôme modulé par l’APP. Grâce à l’utilisation de “ puces à ADN ”, nous avons analysé l’expression de 1200 gènes. Les résultats les plus récents révèlent que la voie de transduction de l’APP contrôle différentes catégories fonctionnelles de gènes (FIGURE 2). L’objectif est dès lors : i) de préciser la fonction de ces gènes ; ii) de conforter leur implication par l’étude histologique de prélèvements de tissus humains.
B) APP et neuroinflammation
Une composante neuroinflammatoire est associée à la MA. De nombreuses cytokines dont l’IL1b le TNFb, et MCP1, sont présentes en quantités accrues dans le cerveau des patients atteints de MA (Akiyama H et al., 2000; Griffin WS et al., 1995; Moore MA, 2002; Xia MQ and BT., 1999). Leur site exact de production est mal connu. Nos travaux d’analyse du transcriptôme (FIGURE 2) montrent que, parmi les classes de gènes activés par l’APP, figurent celles de nombreuses cytokines. Ces premiers résultats suggèrent que le neurone est par lui-même à l’origine de tout ou partie de la réponse inflammatoire. L’analyse des voies de signalisation intraneuronale inductrices de cette réponse ainsi que celle des répercussions fonctionnelles de la production de cytokines constituent les thèmes de notre recherche à venir.

ETUDE DES SIGNALISATIONS
DE LA MORT NEURONALE

Dans les diverses pathologies neurodégénératives, telles que la SLA ou la MA, les troubles cognitifs ou moteurs sont déclenchés par des pertes neuronales. Cette mort neuronale est initiée par des composantes génétiques (SOD ou précurseur APP mutés) ou environnementales spécifiques de chaque pathologie. Cependant, ces signaux “ déclencheurs ” spécifiques agissent sur le neurone en régulant des effecteurs communs qui contrôlent la balance mort/survie de la cellule. Un certain nombre de ces mécanismes ont été identifiés et sont effectivement induits dans certaines pathologies neurodégénératives (production d’un stress oxydatif, activation des caspases, clivage de l’ADN, ou activation de c-Jun et des Jun kinases, etc…).
En poursuivant la caractérisation des effecteurs qui sont responsables de la mort du neurone et en analysant comment ceux-ci sont induits par les signaux “ déclencheurs ”, nous améliorerons significativement notre connaissance des pathologies neurodégénératives.
Nos études portent essentiellement sur deux mécanismes de régulation de la balance mort/survie du neurone : D’une part, la famille de protéine de type p53 (p53, p63 et p73) ; d’autre part, les protéines de remodelage de la chromatine (HDAC et CBP).

A) la famille p53 et la mort neuronale :
La famille des protéines de type p53, codés par les trois gènes p53, p63 et p73, joue un rôle important dans la balance mort/survie du neurone (Arrowsmith, 1999; Yang et al., 2002). P53 induit la mort neuronale (Jordan et al., 1997; Slack et al., 1996) et il est activé dans plusieurs modèles cellulaires de mort neuronale (stress excitotoxique, stress oxydatif, stress génétoxique) (Banasiak and Haddad, 1998; Halterman and Federoff, 1999; Sakhi et al., 1994; Trimmer et al., 1996; Uberti et al., 1998) et dans certaines pathologies neurodégénératives (Syndrome d’Angelman, Ischémie, ALS) (Jiang et al., 1998; Martin, 2000). Nous avons nous-même montré que la protéine p53 et certains de ses gènes cibles étaient régulés dans un modèle animal de SLA (Gonzalez de Aguilar et al., 2000b). Le gène p73 code pour plusieurs isoformes dont certaines ont des effets pro-apoptotiques ou pro-différentiateurs (De Laurenzi et al., 2000), et d’autres isoformes ont des effets protecteurs contre la mort neuronale induite par la déprivation en facteurs neurotrophiques (Pozniak et al., 2000). Notre objectif est de caractériser le rôle de ces facteurs de transcription dans la mort neuronale en général, et dans la SLA et la MA en particulier. Cette étude inclut l’identification des relais intracellulaires qui aboutissent à la régulation des protéines de type p53 en réponse à divers stress neurotoxiques et de déterminer comment au niveau génique ces protéines vont provoquer une mort neuronale.

1°) Résultats préliminaires :
Dans le modèle murin de SLA, nous avons montré que p53 et un de ses gènes cibles sont induits au cours de la mise en place de la pathologie (Gonzalez de Aguilar et al ., 2000a). Une analyse plus fine nous a permis de comprendre comment l’activation de p53 avait lieu pour une part. Nos travaux ont montré que la sérine 15 de p53 était phosphorylée lorsque la SOD mutée est exprimée. Ce site situé près du domaine d’activation et d’interaction avec le régulateur négatif MDM2, est une cible de deux kinases, ATM et ATR, ce qui suggère que l’une de ces kinases ou les deux sont induites au cours de la SLA.
Dans la continuité de cette démarche expérimentale, nous avons commencé une analyse plus poussée du rôle des protéines de type p53 dans l’apoptose neuronale et nous avons obtenu des résultats préliminaires très encourageants (FIGURE 3). Ces travaux concernent, d’une part, une analyse fine des mécanismes de régulation des protéines de type p53, et d’autre part, leur impact sur la mort neuronale.

a) Analyse des mécanismes moléculaires contrôlant les protéines p53
Nous avons initié une analyse des mécanismes de régulation de l’activité de protéines de type p53. Nous avons identifié plusieurs complexes de kinases, telles que les cyclin dependent kinases (CDK) ou les calmodulines kinases (CamK), qui phosphorylent et régulent p73 (Gaiddon et al ., 2003). Ces kinases sont soit activées dans plusieurs modèles de mort neuronale (CDK) ou elles sont importantes pour la régulation de l’équilibre mort/apoptose du neurone. Nous caractérisons maintenant plus finement les sites impliqués et nous vérifions si ces sites sont réglés dans les neurones au cours de l’apoptose.
Nous analysons également le rôle des principaux régulateurs des protéines de type p53 dans l’apoptose neuronal. Nous avions déjà montré précédemment que MDM2 avait un effet neuroprotecteur sur le neurone en grains (Trinh et al ., 2001). Nous étendons maintenant cette analyse, d’une part, aux mécanismes intimes de régulation de cette protéine, et d’autre part, au rôle de MDMX, un homologue de MDM2 qui semble avoir un rôle particulièrement important dans le système nerveux central.

b) Analyse fonctionnelle des protéines de type p53 dans le neurone
Nos résultats préliminaires montrent dans deux modèles, les neurones en grains du cervelet et les souris SOD, une réduction de l’expression des isoformes neuroprotectrices de p73. Dans les neurones en grains, une isoforme aux propriétés pro-apoptotique est également induite aux temps précoces. Une analyse fonctionnelle basée sur l’utilisation de vecteurs d’expression suggèrent que les diverses isoformes de p73 contrôlent de manière homéostatique la survie des neurones en grains du cervelet.

2°) Projets :
À partir des résultats obtenus, nous avons dégagé trois lignes directrices complémentaires qui nous permettrons d’aboutir à une meilleure compréhension du rôle des membres de la famille de p53 dans l’apoptose neuronale, en général, et celle associée à la SLA et à la MA en particulier. Ces trois parties consistent, i) à étudier le rôle des membres de la famille p53 dans l’apoptose neuronale, ii) à identifier les mécanismes qui les régulent, et enfin, iii) à caractériser les gènes cibles qui leur permettent de contrôler le destin du neurone.

a) Analyse du rôle des protéines p53 dans la mort neuronale.
Cette première partie est pour l’instant la plus avancée dans le modèle de neurone en grains du cervelet où nous commençons à comprendre l’impact des diverses isoformes de p73 sur la balance mort/survie du neurone. Ces études sont maintenant étendues aux autres modèles cellulaires (neurone du cortex traités avec l’anticorps APP) et animaux (souris SOD mutées). Ces analyses fonctionnelles vont être renforcées, d’une part, par l’utilisation de RNA interférence, et d’autre part, avec la réalisation de souris transgéniques qui expriment des isoformes dominantes négatives pour chacun des membres de la famille (p53, p63 et p73).

b) Caractérisation des régulations des protéines de types p53 et de leur impact sur la mort neuronale.
Nous avons montré en partie le rôle que joue les protéines de type p53 dans la mort neuronale du neurone en grains (p73) et des motoneurones chez la souris SOD mutée. Nous essayons maintenant de caractériser les relais intracellulaires qui permettent aux signaux “ déclencheurs ” spécifiques des pathologies de réguler l’activité des protéines de type p53 qui sont plutôt considérés comme des effecteurs plus généraux de la mort cellulaire. Il nous semble important de connaître les relais existants entre la spécificité d’un signal pathologique précoce et la mise en route d’un programme commun de mort cellulaire plus tardif dans la cascade des évènements qui aboutit à la pathologie neurodégénérative. Ces relais sont des marqueurs et des cibles thérapeutiques plus précoces de la pathologie et ils sont d’autant plus intéressants. Plusieurs projets sont en cours.
· L’analyse du rôle du site thréonine 86 dans la régulation de l’activité de p73 dans l’apoptose neuronale. Nous avons déjà publié que ce site est phosphorylé par la CDK. Nous étudions maintenant la phosphorylation de ce site dans les neurones. Nous testons également si ce site est la cible d’autres kinases (CDK5, p38) importante dans le contrôle de la survie du neurone.
· L’identification du ou des sites de phosphorylation par les calmoduline-kinases sur p73. Nous avons montré que p73 est phosphorylé in vitro par la calmoduline kinase de type 2, une kinase qui a des effets pro-apopototiques dans les neurones. Nous voulons maintenant caractériser les sites de phosphorylation et développer des anticorps phospho-spécifiques contre ces sites de manière à suivre l’évolution de cette phosphorylation dans les modèles d’apoptose neuronales que nous étudions. Nous analyserons également comment cette phosphorylation à un impact sur les fonctions de p73 dans le neurone.
· Analyse de la dégradation des protéines p73. Nous avons montré que les isoformes neuro-protectrices de p73 disparaissent au cours de la mort neuronale dans les neurones en grains. Nous avons commencé à caractériser les mécanismes de cette disparition. Il semble qu’ils impliquent des protéases de type calpaines et caspases, que nous cherchons à identifier plus précisément.
· Analyse du rôle de MDMX et de MDM2 dans l’apoptose neuronale. Ce projet est menée en collaboration avec les Drs Okamoto et Taya (Cancer center, Tokyo, Japan). Nous avons montré que l’expression de MDMX est réduite au cours de l’apoptose de neurone en grain. Nous explorerons maintenant plus en détail le rôle de cette protéine dans l’apoptose neuronale et comment elle est régulée. Nous essayons également de caractériser plus en détail comment MDM2 est régulé dans le neurone en grains. En particulier, nous analysons si cette protéine est phosphorylée par la kinase AKT dans les neurones et regarderons qu’elle est l’importance de cette phosphorylation pour les fonctions neuroprotectrices de MDM2.

c) Identifications des gènes cibles des protéines p53 dans des cellules neuronales.
Les protéines de la famille de p53 sont des facteurs de transcription. Ces protéines ont des effets positifs sur l’expression de certains gènes et des effets négatifs sur d’autres. La situation est d’autant plus complexe que certaines des isoformes de p73 ont des effets opposés les uns aux autres. La capacité de ces facteurs de transcription à réguler certains gènes plutôt que d’autres est la résultante de plusieurs paramètres. Certains sont propres à la protéine donnée (niveau d’expression, modification post-traductionnelle), d’autres dépendent du contexte (types cellulaires, physiologie de la cellule) qui conditionne la présence d’autres facteurs de transcription qui peuvent coopérer ou bloquer les effets des protéines de type p53. Afin de comprendre comment les protéines de type p53 exercent leur fonction dans les neurones, nous avons initié un projet de recherche qui vise à identifier les gènes cible de p73 dans une lignée neuronale. Nous avons choisi les cellules de neuroblatome N2A qui ont la propriété de se différentier en cellule à phénotype neuronal dans diverses conditions de cultures. Ces cellules sont fréquemment utilisées comme un modèle dans l’étude de l’apoptose neuronale. Nous réalisons des lignées stables de N2A où l’expression de deux isoformes de p73 est inductible. À partir de ces lignées, nous identifierons les gènes cibles de p73 dans des conditions contrôles et dans des conditions de mort neuronale en utilisant la technique de micro-arrays d’AffimétrixTM.
Parallèlement à cette approche exhaustive, nous analysons aussi l’expression de gènes cibles des protéines p73 déjà connus et qui ont une signification physiopathologique particulière dans les modèles de mort neuronale que nous étudions.

B) Signalisation moléculaire dans la MA : role des enzymes de remodelage chromatinienne.
Depuis qu'a été posée l'hypothèse de l'existence de similitudes mécanistiques entre l'entrée en mitose d'une cellule qui se croît et l'entrée en apoptose d'une cellule post-mitotique comme le neurone (Freeman et al., 1994; Heintz, 1993; Philpott et al., 1996), de nombreuses études montrent clairement l'existence de l’activation des gènes du cycle cellulaire dans des modèles in vitro ou in vivo, ainsi que dans certaines neuropathologies. L'analyse de cerveaux de patients souffrant de MA a révélé la présence des protéines nécessaires au déroulement du cycle cellulaire comme les cyclines, les kinases dépendantes des cyclines ou leurs inhibiteurs (Busser et al., 1998; Maccioni et al., 2001; McShea et al., 1997; Ogawa et al., 2003; Vincent et al., 1997).
Il est intéressant de noter que l’activation des gènes du cycle cellulaire se retrouve dans certaines pathologies, et notamment dans la maladie d’Alzheimer (Nagy, 2000). Cette tentative d'initiation du cycle dans les neurones serait suivie de leur incapacité à établir les régulations nécessaires aux phases tardives du cycle. L’analyse de cerveaux de patients montre en effet que les taux de plusieurs types de cyclines (B, D et E) et de Cdk4 et Cdc2 augmentent (Busser et al., 1998; McShea et al., 1997; Vincent et al., 1997). A l’inverse, on note une dégradation accrue de l’inhibiteur de cdk p27 dans les neurones présentant des dégénérescences fibrillaires (Ogawa et al., 2003).

Nous nous intéressons aux régulations qu'exerce la balance HDAC et HAT dans les neurones matures et dans les neurones apoptotiques. En effet, une dérégulation sur l'une de ces enzymes ou l'un de leurs co-facteurs pourrait être à la base de la réactivation inappropriée des gènes du cycle cellulaire et/ou de l'activation de gènes pro-apoptotiques au cours des maladies neurodégénératives (FIGURE 4). Un exemple de ce type de dérégulation a été récemment documenté par plusieurs laboratoires, pour la HAT CBP (CREB-binding protein) dans le cas de la maladie de Huntington. En effet, la protéine mutée htt serait capable d’induire une perte de fonction de CBP, soit en bloquant son domaine acetyltransférase (Steffan et al., 2001; Steffan et al., 2000), soit en induisant sa dégradation (Jiang et al., 2003). Dans certains cas, le traitement de drosophile ou de souris par des inhibiteurs de HDACs permet d’améliorer leur viabilité (Hockly et al., 2003; Ryu et al., 2003). L’équilibre entre les activités HDAC et HAT est donc bien une cible potentielle des signalisations neuronales protectrices et apoptotiques. Ceci nous permet d'espérer qu’à terme, ce programme de recherche débouchera sur de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans la maladie d'Alzheimer.
1°) Stratégies expérimentales:

QUESTIONS:
Quels sont les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la perte de CBP dans la signalisation de l'APP et les neurones corticaux? Ces mécanismes sont-ils mis en jeu au cours de la perte neuronale survenant au cours la maladie d'Alzheimer?
L'apoptose neuronale est-elle associée à une perte spécifique de CBP ou plus généralement à une perte d'activité de toutes les HATs cellulaires? Peut-on jouer avec la balance HDAC/HAT pour prévenir la perte neuronale survenant au cours de l'apoptose?

Dans cette partie du projet nous voulons déterminer comment les mutations de l’APP, qui sont des facteurs de sensibilité pour le déclenchement de la maladie d’Alzheimer, exercent leurs effets à l’échelle cellulaire. Nous nous intéressons, plus particulièrement, à l’hypothèse selon laquelle les enzymes régulateurs des niveaux d'acétylation cellulaires sont mis en jeux dans les processus d’apoptose neuronale. Les résultats préliminaires obtenus sur CBP et mettant en évidence une dégradation précoce de cette protéine au cours de l’apoptose neuronale induite par activation de la voie APP (ACL-31, ACL-49) permettent de valider l’hypothèse de l’implication fonctionnelle de la balance HAT/HDAC dans les mécanismes moléculaires de signalisation de l’APP.

La démarche expérimentale consiste à activer l’APP à l’aide de ligands extracellulaires afin d’analyser la/les voie(s) efférente(s)de signalisation. Pour cela, nous avons développé et caractérisé un modèle in vitro, une culture primaire de neurones corticaux de souris, traitée avec un anticorps dirigé contre le domaine extracellulaire N-terminal de l’APP. L’anticorps utilisé (Ab-APP) a été développé au laboratoire: le peptide épitope APP66-81 de souris a été injecté à des poules et les anticorps polyclonaux ainsi générés, purifiés à partir des œufs (IgY) par Covalab (Lyon, France). Les travaux effectués montrent que l’exposition des neurones corticaux à l’Ab-APP induit la mort cellulaire. Cette mort neuronale est précédée par une résorption neuritique et elle est médiée par une voie apoptotique (Mbebi et al., 2002). De plus, ce modèle a permis d’analyser certaines voies de transduction activées par l’APPet de montrer que l’activation de l’APP module négativement les voies neuroprotectrices des protéines kinases dépendantes du calcium et de la calmoduline (CamK de type IV), et plus particulièrement au niveau de la protéine CREB (cyclic AMP-responsive element binding protein) (ACL-31).

a) Mécanismes moléculaires impliqués dans la dégradation de CBP:
Ces mécanismes peuvent impliquer des caspases ou des calpaïnes, qui sont des protéines effectrices typiques des signalisations pro-apoptotiques. Nos travaux effectués dans les Neurones en Grains du Cervelet (NGC) montrent la participation de la caspase-6 dans la dégradation de CBP, ainsi que des calpaïnes. Nos résultats antérieurs montrent que, dans le modèle de neurones corticaux, l’activation par l’APP se répercute plus particulièrement sur les calpaïnes, les caspases n’étant que pas ou peu induites (ACL-31). Il sera intéressant de vérifier si la caspase-6 est finalement induite ou non par la signalisation de l'APP. En effet, la procaspase-6 est détectée dans des cerveaux humains et le fragment actif p10 de la caspase-6 a été mis en évidence dans des cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer (LeBlanc et al., 1999). Ces auteurs montrent également que la caspase-6 est impliquée dans le processing de l'APP et la production de protéine ß-amyloïde (Gervais et al., 1999; LeBlanc et al., 1999).

b) Mesure de l'activité des HAT/HDAC en réponse à la signalisation de l'APP:
L’activité enzymatique des différents enzymes (CBP et HDAC; kits disponibles chez Upstate Biotechnology) sera évaluée en réponse à l’Ab-APP dans les neurones corticaux. Une mesure de l’activité de CBP permettra de confirmer si la baisse des niveaux de CBP observée se traduit effectivement par une baisse de son activité, de façon à déterminer si le site actif de l’enzyme est dégradé.
Des mesures d’activité HAT globale permettront de vérifier si d’autres HATs comme p300 ou P/CAF sont touchées par l’activation de l’APP. Pour cela, nous pourrons également réaliser ensuite des Western blots à l’aide d’anticorps spécifiques, ainsi que des tests d’activité enzymatique après immunoprécipitation avec ces anticorps. Il sera également intéressant de confronter ces résultats avec l'activité d'autres HAT, et notamment de Tip60, qui interagit avec l’APP.
Nous avons commencé à évaluer les niveaux d’HDACs en réponse à l’activation de la voie APP. Les isoformes HDAC 1, 2 et 3 ont pu être mises en évidence par western blot avec un anticorps spécifique (Upstate Biotechnology) et les quantités de ces différentes isoformes d’HDACs ne semblent pas varier en réponse à un traitement par l’Ab-APP (résultats non publiés). Une mesure de l’activité HDAC globale permettra de vérifier s'il existe des modifications sur toutes les isoformes.

c) Effet des différentes mutations de l'APP sur ces signalisations:
L'effet de différentes mutations de l'APP pourra être testé dans ce contexte, en utilisant la dégradation de CBP comme réponse cellulaire. En collaboration avec le laboratoire des Dr. JN Octave et P. Kienlen-Campard (Université de Louvain, Bruxelles), nous projetons de transfecter diverses mutations de l'APP à l'aide d'adénovirus dans les cultures primaires de neurones corticaux ou les NGC, pour en étudier la signalisation, et notamment, les répercussions sur les niveaux de CBP ou d'autres HATs.

d) Effet des inhibiteurs de HDACs:
Dans le cadre des données expérimentales développées ci-dessus et en fonction des résultats obtenus sur les activités HAT/HDAC, nous essayerons de voir si les inhibiteurs de HDAC sont capables de reverser la mort induite par la signalisation de l'APP.

e) Validation dans les pathologies humaines:
Les résultats princeps obtenus dans les cultures primaires de neurones seront vérifiés sur des coupes de cerveaux humains. En collaboration avec le Professeur Bellocq et le Dr. Lannes (Centre anatomopathologie, CHU, Strasbourg), ainsi qu'avec les Dr. Delacourte et L. Buée (INSERM U422, groupe VCDN, Lille), nous avons accès à des cerveaux humains post-mortem de sujets sains ou de patients atteints de la maladie d’Alzheimer. Ces tissus permettent également de réaliser des marquages immunohistologiques, ainsi que des analyses biochimiques des protéines par western blot dans les différentes zones du cerveau.

Globalement, ce projet de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires induits par l’activation de l’APP, ainsi que l'implication des acétylations dans ces signalisations. Un point fort de cette étude est la validation des résultats sur des cerveaux de sujets atteints de la maladie d’Alzheimer. Il nous permet d'espérer qu’à terme, ces études sur de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles (au niveau du contrôle de la balance enzymatique HAT/HDAC cellulaire) dans la maladie d'Alzheimer.

IV) Corrélats anatomo-biologiques et constitution de BANQUES DE TISSUS
En terme d’affections neurodégénératives l’anatomie pathologique reste, à l’heure actuelle, le seul moyen d’affirmer le diagnostic. Les biopsies de tissu nerveux sont un geste invasif, qui n’est jamais envisagé en l’absence de traitement étiologique de l’affection soupçonnée. C’est donc à l’autopsie qu’il faut avoir recours. Etablir un diagnostic positif, même s’il n’est posé qu’après le décès du patient, est essentiel pour au moins deux raisons :
- sur le plan de la recherche fondamentale, la vérification sur tissus humains pathologiques, d’hypothèses issues de la recherche fondamentale (dans des modèles in vitro et dans des modèles animaux) est une étape indispensable à leur validation.
- la mise en place d’essais thérapeutiques avec des molécules à visée étiologique devra obligatoirement vérifier sur des critères neuropathologiques si des sujets ont été inclus à tort, les critères cliniques et paracliniques pouvant être trompeurs.

A) Faisabilité
La pratique de l’autopsie est malheureusement tombée en désuétude presque partout en France, et des voix commencent à s’élever contre les conséquences graves de la perte de cette pratique (Seilhan, 2002). Cependant cette pratique reste relativement courante à Strasbourg, notamment en ce qui concerne les affections neurodégénératives. Cela est dû à l’existence d’un réseau associant des neurologues, des gériatres et des neuropathologistes motivés. La plupart des participants à ce réseau collaborent à ce projet de recherche.
Des cerveaux humains peuvent être obtenus de deux façons : soit lors d’autopsies réalisées dans le cadre de dons à visée scientifique ; soit, le plus souvent, dans le cadre d’autopsies réalisées à des fins diagnostiques, dont les prélèvements pourraient donner lieu à une requalification à visée scientifique.
Nous avons donc le projet de réaliser de façon prospective et dans le cadre législatif actuel, une banque de tissus neuropathologiques. La constitution de cette banque dans les années qui viennent devra se faire en connexion avec le Centre de Ressources Biologiques (CRB), en cours de mise en place aux HUS et seul susceptible d’acquérir des tissus humains selon une procédure d’assurance-qualité qui garantisse le consentement et la sécurité des personnes, la protection de l’environnement et la traçabilité du tissu. Cette stratégie permettrait de fournir pour la recherche des tissus émanant de patients pour lesquels on dispose de données cliniques validées (épidémiologiques, sémiologiques, diagnostiques), avec l’assurance que le prélèvement, la conservation et la distribution répondent à des exigences de qualité et de conformité aux dispositions. Outre la conformité avec la législation en vigueur, la réalisation d’une telle banque permettra de disposer de matériel congelé, ce qui n’est pas le cas actuellement. Le concours des associations de malades concernées sera également recherché.

B) Etude de la SLA humaine
Des travaux antérieurs réalisés au laboratoire ont montré l’implication de gènes de la famille des (RTN) dans la SLA. Les réticulons sont une famille de 4 gènes (RTN1 à RTN4) produisant différents transcrits par épissage alternatif. La plupart de ces gènes sont exprimées dans le système nerveux central, encéphale et moelle épinière.
RTN3 est fortement exprimé dans le système nerveux central adulte et au cours du développement, notamment dans le cortex, l’hippocampe, les noyaux gris centraux, le tronc cérébral et la moelle épinière (Moreira et al., 1999; Oertle et Schwab, 2003).
NOGO-A (RTN4-A) est aussi retrouvé dans l’ensemble du système nerveux central adulte et au cours du développement. Il est exprimé physiologiquement par les oligodendrocytes et quelques populations neuronales (Oertle et Schwab, 2003).
Nous avons montré que RTN3 était réprimé alors que NOGO-A est induit, très précocement dans la moelle épinière de souris SOD1 G86R, montrant ainsi l’implication probable de ces gènes dans la SLA.
Nous évaluerons par immunohistochimie à l’aide d’Ac spécifiques générés dans le laboratoire :
- la localisation cellulaire précise chez le sujet normal des protéines codées par RTN3 et NOGO-A, au besoin à l’aide de doubles marquages permettant une identification précise des cellules exprimant ces protéines.
- l’expression comparative de ces protéines entre des sujets atteints de SLA et des sujets normaux. Différentes structures atteintes dans la SLA ou dans la démence de type maladie du motoneurone (forme de SLA avec démence fronto-temporale) seront ainsi étudiées : la moelle épinière, le tronc cérébral, l’hippocampe, le striatum et le cortex.

C) Etude de la MA humaine

SP1 (specificity protein 1) est le chef de file d’une famille de facteurs de transcription cellulaire comprenant essentiellement SP1, SP3 et SP4. Ces protéines se lient à des GC boxes présentes dans de nombreux promoteurs cellulaires. SP4 serait exprimé essentiellement dans les neurones Les protéines de la famille SP réguleraient l’expression de gènes impliqués notamment dans la régulation du cycle cellulaire et le développement (Suske, 1999). Or, l’expression anormale de marqueurs du cycle cellulaire et la réactivation de voies de transduction du signal normalement actives au cours du développement ont été décrites dans la MA. De plus, les promoteurs des gènes de l’APP et de tau contiennt des GC boxes (Pollwein et al., 1992). Nous avons fait l’hypothèse que les facteurs de transcription de type SP pourraient être impliqués dans la physiopathologie de la MA.
Nous avons ainsi récemment montré par Western Blot une surexpression des facteurs de transcription SP3 et SP4 dans l’hippocampe de sujets atteints de MA. Par immunohistochimie nous avons pu montrer que cette surexpression était présente dans les cellules pyramidales de la corne d’Ammon (CA1) et était colocalisée avec les dégénérescences neurofibrillaires (DNF), l’une des deux lésions caractéristiques de la maladie. Des travaux visant à étudier plus avant cette surexpression dans la MA sont en cours.

Les RTN pourraient également être impliqués dans la MA. Si leurs fonctions physiologiques sont encore loin d’être connues, différents travaux portant notamment sur NOGO-A montrent qu’ils inhibent la croissance neuritique. Leur surexpression à la suite de lésions pourrait expliquer la très mauvaise aptitude du SNC à régénérer en comparaison avec le système nerveux périphérique. En d’autres termes, les RTN sont des facteurs qui inhibent et limitent la plasticité du SNC.
Or, il a été montré au cours de ces dernières années que les DNF qui sont les lésions neuropathologiques les plus corrélées au déficit cognitif, débutent toujours dans le cortex entorhinal et l’hippocampe qui sont normalement les structures les plus plastiques de l’encéphale. A contrario, les DNF apparaissent très tardivement et restent peu intenses dans les structures les moins plastiques que sont les cortex primaires (Braak and Braak, 1997 ; Delacourte et al., 1999). Ce gradient d’atteinte de régions cérébrales, en fonction du degré de la plasticité des structures concernées est spécifique de la MA. Nous faisons donc l’hypothèse d’une surexpression des RTN dans la MA. Afin de vérifier cette hypothèse, nous étudierons par immunohistochimie :
- le niveau d’expression de NOGO-A et RTN3 dans différentes structures cérébrales atteintes de façon séquentielles et différentielles dans la MA.
- nous comparerons ces niveaux d’expressions non seulement à ceux de cerveaux de sujets normaux, mais également à des cerveaux de sujets atteints d’autres types de démence, afin de vérifier la spécificité de l’implication des RTN au cours de la MA.


V) RESUME/CONCLUSION
La recherche qui est menée dans notre unité suit une trajectoire qui, à partir d’études fondamentales (signalisation intracellulaire de la mort neuronale), s’est orientée vers les pathologies neurodégénératives, avec, pour le futur, des objectifs à la fois diagnostiques et thérapeutiques. La pluridisciplinarité, associant chercheurs et cliniciens de terrain investis dans la recherche, nous semble être un gage d’interactions fécondes et de réussite potentielle.

CONTEXTE GENERAL DE LA RECHERCHE

Les affections neurodégénératives regroupent diverses affections dont un grand nombre engendre des tableaux démentiels (maladie d’Alzheimer, démence fronto-temporale, maladie à corps de Lewy diffus, pour les plus fréquentes) et d’autres des troubles plutôt moteurs (sclérose latérale amyotrophique, maladie de Parkinson). Toutes ces affections ont en commun de retentir sur la vie familiale, sociale et professionnelle des patients et d’entraîner une perte d’autonomie dont la prise en charge, en l’absence de traitement spécifique, hors la maladie de Parkinson, nécessite un investissement de la famille et des acteurs de santé.

La maladie d’Alzheimer (MA) est la cause la plus fréquente de démence puisqu’elle est en cause dans environ 50% des cas, ce qui représente plus de 400000 patients en France. Son incidence est de 110000 cas par an, dont les deux tiers concernent des sujets de plus de 80 ans, ce qui laisse, compte tenu du vieillissement de la population, augurer d’une augmentation considérable du nombre de cas à partir de 2010. Il n’existe à ce jour pas de stratégie efficace de prévention de cette affection, dont l’origine, possiblement multifactorielle, reste méconnue. 75% des patients vivent à domicile, ce maintien étant possible grâce à la famille pour laquelle cette prise en charge est éprouvante et coûteuse (2000 à 3000 Euros/mois). Avec le temps, l’entrée en institution est souvent inévitable, et les “déments” représentent 50% des patients accueillis en établissement d’hébergement pour personnes âgées dépendantes.

La MA pose donc un réel problème de santé publique, au point qu’en 2001 le ministre de la santé a proposé un programme en six points (identifier les symptômes, structurer l’accès à un diagnostic de qualité, préserver la dignité des malades, soutenir et informer les patients et leurs familles, améliorer la qualité des structures, favoriser les études et la recherche clinique).

Un pas décisif vers d’éventuels tests diagnostiques précoces et vers des thérapeutiques préventives et/ou curatives sera fait le jour où les mécanismes moléculaires en cause seront connus. Cette connaissance nécessite des recherches cliniques et fondamentales, et impose une étroite collaboration entre cliniciens concernés (gériatres, neurologues, biologistes anatomopathologistes), et chercheurs.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative du système nerveux qui atteint les neurones moteurs (motoneurones) du tronc cérébral, de la moelle épinière et du cortex cérébral, et entraîne des paralysies musculaires. Son incidence est de 1,5/100000 par an, et l’on estime que 4500 personnes sont actuellement touchées. La SLA touche le plus souvent des adultes jeunes vers 55 ans. L’évolution peut être rapidement fatale, en moins de deux ans, ou s’étaler, dans les formes à évolution lente, sur plusieurs années. Il existe des formes familiales (10%) et des formes sporadiques.
En l’absence de traitement étiologique “curatif”, la prise en charge repose sur le traitement des symptômes, la rééducation kinésithérapique et orthophonique dont le principe est d'entretenir les fonctions musculaires restantes, et d’adapter des dysfonctions motrices par des appareillages adaptés au handicap. Seul le riluzole qui réduit la neurotoxicité glutamatergique est susceptible de ralentir l’évolution.
En 2002, la SLA a donné lieu à un appel d’offres de la part du ministère de la santé (Circulaire DHOS/O/DGS/SD 5 D/DGAS n° 2002-229 du 17 avril 2002 relative à l'organisation des soins pour la prise en charge des patients souffrant de sclérose latérale amyotrophique) pour la création de centres de référence dont les missions sont: d’améliorer l'accès au diagnostic et accompagner l'annonce ; de réunir et organiser l'interdisciplinarité nécessaire au suivi de ces situations cliniques complexes et continuellement évolutives ; d’assurer le transfert de connaissances et de savoir-faire auprès des acteurs de proximité et la mise en oeuvre des moyens nécessaires sur le lieu de vie ; de participer à la collecte des données et aux programmes de recherche. C’est dire l’intérêt porté à la mise en commun des compétences.
L’étude des mécanismes moléculaires intervenant dans la mort neuronale, aussi bien sur des neurones que sur des souris transgéniques, a permis à notre équipe de montrer d’une part que l’induction précoce de la forme A du gène nogo pouvait constituer un marqueur diagnostique de la maladie, et d’autre part le rôle primordial du métabolisme énergétique musculaire.
Une connaissance plus précise de ces deux affections à évolution lente particulièrement handicapantes pour les sujets atteints nécessite une étroite collaboration entre chercheurs et cliniciens. Ajouter à la classique confrontation anatomo-clinique une composante “ biologique moléculaire ” fera non seulement évoluer la connaissance des mécanismes moléculaires, mais permettra la mise au point de tests diagnostiques précoces, et ouvrira des perspectives thérapeutiques. Cette collaboration est à la base du projet quadriennal puisque des cliniciens (neurologues et gériatres pour le diagnostic et la sélection de patients), et des anatomopathologistes (pour les banques de tissus) sont partie prenante.
Cette démarche s’inscrit dans l’historique de l’équipe de recherche dont les travaux ont toujours été centrés sur les mécanismes de signalisation intraneuronaux. De la connaissance de plus en plus poussée de ces mécanismes est née l’idée qu’ils participent également aux processus de mort neuronale. Cet intérêt pour les mécanismes de neurodégénérescence, soutenu par l’ULP, a conduit à un rapprochement du laboratoire avec la Faculté de Médecine dans le cadre du développement de recherches associant cliniciens et fondamentalistes. Cette orientation est soutenue par le conseil de faculté, et plus particulièrement par le doyen et par le responsable des projets de recherche.

PROGRAMME DE RECHERCHE
Les travaux actuels des membres de l’EA 3433 visent à élucider les mécanismes cellulaires, communs et/ou spécifiques, des maladies neurodégénératives, et en particulier ceux qui sous-tendent la MA et la SLA. Les stades les plus précoces de ces pathologies sont les plus intéressants à analyser, car l’élucidation des mécanismes à ces stades peut faire espérer un débouché thérapeutique, préventif et peut-être curatif, ou tout au moins de stabilisation. Les démarches expérimentales en cours s’adressent à ces deux pathologies, à la fois pour des raisons de santé publique (cf supra), et parce qu’elles relèvent sans doute, au moins en partie, de mécanismes communs. Cependant, pour des raisons didactiques, c’est successivement que pour chacune de ces pathologies seront exposées les modalités d’étude au sein d’un programme de recherche cohérent et intégré qui aborde : i) les mécanismes cellulaires de la mort neuronale ; ii) les mécanismes spécifiques grâce à des modèles in vivo (animaux transgéniques) ; iii) les corrélats anatomo-biologiques grâce à l’analyse de prélèvements post-mortem (tissus nerveux de patients) et/ou de prélèvements biopsiques (muscle dans le cas de la SLA). Puis seront détaillées les recherches fondamentales in vitro obtenues à partir de “ modèles simplifiés ”, et concernant les mécanismes de la mort neuronale et leurs implications dans les maladies neurodégénératives. Enfin l’intérêt des “ banques de tissus ” sera souligné.

I) ETUDE DES MECANISMES PRECOCES DE LA SLA

A) Les mécanismes de la SLA : données du problème

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective des motoneurones du cortex, du tronc cérébral et de la moelle épinière (Hand and Rouleau, 2002). Elle se traduit par une amyotrophie et une paralysie progressive des motricités volontaires, automatiques et réflexes dues à la perte précoce des neurones du système moteur. La majorité des cas de SLA sont des cas sporadiques mais environ 10% des cas sont des formes familiales à transmission dominante. D’un point de vue clinique, il n’est pas possible de discriminer une SLA familiale d’une SLA sporadique, ce qui suggère des mécanismes communs dans le processus de dégénérescence des motoneurones. Dans environ 20% des cas familiaux, la maladie est liée à la présence d’une mutation dans le gène codant la superoxyde dismutase 1 (SOD1; Rosen et al., 1993), une enzyme de détoxification radicalaire qui protège les cellules contre le stress oxydant. Plus de 80 mutations dominantes différentes du gène codant la SOD1 ont été identifiées et corrélées à l'apparition d'une SLA. L'identification de ces mutations à permis la génération de souris transgéniques exprimant différentes mutations de la SOD1 humaine ou murine (Bruijn et al., 1997; Gurney et al., 1994; Ripps et al., 1995; Wong et al., 1995). L’introduction de cette mutation par transgenèse dans une lignée de souris normales induit chez ces animaux l’apparition de symptômes comparables à ceux qui sont observés dans la SLA (paralysie progressive avec dégénérescence des motoneurones spinaux) dont la gravité est proportionnelle au degré d'expression du transgène. Si la relation entre mutation de la SOD1 et SLA est maintenant clairement établie, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathologie sont en revanche peu documentés. Plusieurs hypothèses ont été émises quant aux moyens par lesquels ces mutations entraînent une modification de l’activité synaptique et conduisent à la dégénérescence neuronale: stress oxydant, facteurs environnementaux, excitotoxicité, anomalie du cytosquelette etc... la diversité des propositions reflète sans doute la complexité des mécanismes mis en jeu. La SOD1 est une enzyme de détoxification des radicaux superoxides et l’implication des formes mutées dans l’apparition de la pathologie tend à appuyer l’hypothèse du stress oxydant comme initiateur des processus dégénératifs.
Un autre point toujours en suspens dans la SLA est l’origine cellulaire de cette maladie. Il est maintenant largement accepté que les motoneurones meurent via des processus apoptotiques impliquant l’activation de caspases (Pasinelli et al., 2000) et la voie mitochondriale (Gonzalez de Aguilar et al., 2000a; Guegan et al., 2001). De plus, il a été montré que l’utilisation d’inhibiteurs de caspases (Li et al., 2000) ou la surexpression de Bcl2 par transgenèse (Vukosavic et al., 1999) ralentissent l’apparition de la pathologie. Cependant, les événements initiant ce processus de mort neuronale sont toujours inconnus : la surexpression ciblée de la SOD1 mutée, soit dans les (Gong et al., 2000), soit dans les motoneurones (Lino et al., 2002; Pramatarova et al., 2001), ne conduit pas au développement de la pathologie. Ces résultats suggèrent donc que l’expression spécifiquement astrocytaire ou neuronale de la SOD1 mutée n’est pas suffisante, à elle seule pour conduire à la mort motoneuronale par apoptose.
Notre hypothèse est que l’expression musculaire de la SOD1 mutée est essentielle à l’initiation de la pathologie.
Plusieurs indices soulignent l’importance de la composante musculaire dans le développement de la maladie. D’un point de vue clinique, l’apparition de la maladie se traduit par un rapide déclin de la force musculaire et une perte massive des mitochondries (Chung and Suh, 2002). Cette dégénérescence mitochondriale est associée à un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire des mitochondries au niveau musculaire tant chez les patients (Siciliano et al., 2001) que dans les modèles animaux (Leclerc et al., 2001). De plus il est remarquable que la créatine, substrat du métabolisme énergétique au niveau musculaire ait un effet neuroprotecteur dans la lignée G93A (Klivenyi et al., 1999), et que chez des malades traités à la créatine, les symptômes musculaires soient atténués (Mazzini et al., 2001). On peut donc penser que l’atteinte musculaire primaire est directement liée à un dysfonctionnement mitochondrial.

1°) Résultats préliminaires.
Nos résultats laissent à penser qu’il existe une importante composante musculaire dans le déclenchement de la SLA. Lors d’un criblage différentiel réalisé afin d’identifier les programmes génétiques modifiés précocement dans le modèle G86R de SLAF, nous avons constaté de très importantes modifications du transcriptôme au niveau de la moelle épinière lombaire, bien avant l’apparition des premiers symptômes moteurs. En plus des modifications de nature purement neuronale, comme par exemple la modification de moteurs moléculaires impliqués dans le transport axonal (Dupuis et al., 2000), notre criblage nous a également permis de montrer qu’à un stade asymptomatique, de nombreux processus régulant l’activité cellulaire (propriétés électriques, métabolisme intermédiaire, protéines de la myéline, protéines impliquées dans la croissance axonale…) sont modifiés (Figure 1). Ces modifications ne sont pas spécifiques à la moelle épinière mais se retrouvent également au niveau du muscles gastrocnénien. Parmi les gènes réprimés, nombreux sont ceux impliqués dans la biogenèse mitochondriale et le métabolisme intermédiaire (manuscrit en préparation) et cette répression se retrouve, là encore, au niveau du muscle squelettique, un tissu clé d’un point de vue métabolique. Nous nous sommes donc demandé si la répression de ces gènes pouvait refléter une déficience métabolique plus généralisée et nous avons entrepris une étude sur l’animal entier. Nous avons constaté que les souris SOD1-G86R, bien qu’hyperphagiques, sont plus maigres que les souris contrôles de la même fratrie. Cet hypermétabolisme est dû a une augmentation de la dépense énergétique et contribue à la dégénérescence neuronale puisqu’un régime alimentaire hyperlipidique retarde significativement l’apparition de la maladie et augmente la longévité des souris G86R. Ces résultats appuient eux aussi notre hypothèse concernant l’implication de la composante musculaire dans l’initiation de la pathologie.
Dans ce projet, nous allons explorer cette hypothèse en utilisant des approches complémentaires dans le modèle des G86R et chez les patients SLA afin d’identifier de nouveaux mécanismes et de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la SLA.



<strong>B) Projet.
1°) Identification de nouvelles cibles pour le diagnostic et le traitement de la SLA : apport des modèles animaux.
La première partie de ce projet à pour objectif d’identifier de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la SLA en utilisant les modèles animaux comme point de départ, puis de valider ces résultats dans des biopsies musculaires de patients SLA. Deux approches complémentaires seront utilisées :

- Réalisation de puces à ADN (technologie Affymétrix™) à partir de muscles de souris SOD1 mutée. Cette approche nous permettra d’identifier les gènes spécifiquement régulés chez les souris mutées. Après analyse des résultats, les gènes retenus pour leur potentiel en tant que cible thérapeutique et/ou marqueur diagnostique seront étudiés sur des biopsies musculaires de patients atteints de différentes pathologies neuromusculaires incluant des SLA sporadiques. Ces études nous permettrons donc d’identifier des marqueurs moléculaires spécifiques de la SLA. Ce projet a de fortes implications cliniques puisque ces marqueurs moléculaires devraient permettre de mettre au point de nouveaux outils diagnostiques applicables après des procédures peu invasives (biopsie musculaire). La validation d’un tel diagnostic moléculaire nous permettra de simplifier les essais thérapeutiques en préselectionnant des groupes de patients et en permettant de suivre l’évolution d’une éventuelle thérapie sur un même individu. De plus, cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires altérés dans la SLA, et, nous l’espérons, de développer des thérapies plus efficaces.

- Afin de vérifier l’importance de l’expression purement musculaire de la SOD1 mutée dans le déclenchement et/ou la progression de la maladie, et de confirmer formellement notre hypothèse, nous sommes en train de générer des souris transgéniques n’exprimant la SOD1G86R que dans le muscle squelettique grâce au promoteur de la créatine kinase musculaire. Si notre hypothèse initiale est correcte, ces souris devraient développer à leur tour une SLA. Cette approche nous permettra de développer un nouvel outil de modèlisation de la SLA et nous ouvrir de nouvelles perspectives quant à la la recherche de nouvelles thérapies et à la prise en charge clinique des patients.


2°) Utilisation de biopsies musculaires pour la recherche de nouvelles cibles pour le diagnostic et le traitement de la SLA.
La seconde partie de ce projet à pour objectif d’étudier, de façon “ extensive ”, le transcriptôme musculaire de patients atteints de SLA en utilisant la même technologie que précédemment (puces à ADN, technologie Affymétrix™). Ce type d’approche a déjà été utilisé avec succès dans d’autres domaines du champ médical, fournissant des outils prometteurs pour le diagnostic et le pronostic de plusieurs maladies.

Cette étude va inclure une série de 20 patients atteints de SLA, recrutés au centre SLA de l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière, ainsi que de patients contrôles provenant de chirurgies orthopédiques, et également de patients atteints d’autres pathologies neuromusculaires (voir Dupuis et al., 2002). Les biopsies musculaires non invasives seront réalisées chez les patients sous anesthésie locale à l’hôpital, puis les échantillons nous seront envoyés au laboratoire pour pratiquer les analyses. Les gènes identifiés comme étant régulés chez les patients atteints de SLA seront ensuite étudiés en détail chez la souris G86R par les techniques utilisées en routine au laboratoire (biologie moléculaire, techniques morpho-fonctionnelles, transfection etc…) afin de démontrer la signification fonctionnelle de nos résultats.

Financement : toutes les études décrites dans ce projet sont actuellement financées par des crédits provenants de l’Association Française pour la Recherche sur la SLA et autres maladies du motoneurone, ainsi que par l’ALSA (american ALS association). Des subventions ont également été obtenues auprès de compagnies pharmaceutiques, et nous travaillons actuellemnt au développement de brevets pour de nouveau marqueurs diagnostiques et de cibles thérapeutiques. De plus nous sommes en négociation avec des partenaires industriels pour financer un essai clinique de phase 1/2.
Aspect éthique : Ce projet a déjà été soumis et approuvé par le comité d’éthique de l’hôpital de la pitié Salpêtrière. Le travail sur les souris G86R est actuellement soumis au comité local d’expérimentation animale de Strasbourg.

CONCLUSION : Ce projet a pour but de caractériser en détail les changements précoces du transcriptôme musculaire dans la SLA afin d’identifier de nouveaux marqueurs moléculaires utilisables pour le diagnostic ainsi que des cibles potentielles pour de nouvelles thérapies.