Le Blog d'AREMANE

CONTEXTE GENERAL DE LA RECHERCHE

Les affections neurodégénératives regroupent diverses affections dont un grand nombre engendre des tableaux démentiels (maladie d’Alzheimer, démence fronto-temporale, maladie à corps de Lewy diffus, pour les plus fréquentes) et d’autres des troubles plutôt moteurs (sclérose latérale amyotrophique, maladie de Parkinson). Toutes ces affections ont en commun de retentir sur la vie familiale, sociale et professionnelle des patients et d’entraîner une perte d’autonomie dont la prise en charge, en l’absence de traitement spécifique, hors la maladie de Parkinson, nécessite un investissement de la famille et des acteurs de santé.

La maladie d’Alzheimer (MA) est la cause la plus fréquente de démence puisqu’elle est en cause dans environ 50% des cas, ce qui représente plus de 400000 patients en France. Son incidence est de 110000 cas par an, dont les deux tiers concernent des sujets de plus de 80 ans, ce qui laisse, compte tenu du vieillissement de la population, augurer d’une augmentation considérable du nombre de cas à partir de 2010. Il n’existe à ce jour pas de stratégie efficace de prévention de cette affection, dont l’origine, possiblement multifactorielle, reste méconnue. 75% des patients vivent à domicile, ce maintien étant possible grâce à la famille pour laquelle cette prise en charge est éprouvante et coûteuse (2000 à 3000 Euros/mois). Avec le temps, l’entrée en institution est souvent inévitable, et les “déments” représentent 50% des patients accueillis en établissement d’hébergement pour personnes âgées dépendantes.

La MA pose donc un réel problème de santé publique, au point qu’en 2001 le ministre de la santé a proposé un programme en six points (identifier les symptômes, structurer l’accès à un diagnostic de qualité, préserver la dignité des malades, soutenir et informer les patients et leurs familles, améliorer la qualité des structures, favoriser les études et la recherche clinique).

Un pas décisif vers d’éventuels tests diagnostiques précoces et vers des thérapeutiques préventives et/ou curatives sera fait le jour où les mécanismes moléculaires en cause seront connus. Cette connaissance nécessite des recherches cliniques et fondamentales, et impose une étroite collaboration entre cliniciens concernés (gériatres, neurologues, biologistes anatomopathologistes), et chercheurs.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie dégénérative du système nerveux qui atteint les neurones moteurs (motoneurones) du tronc cérébral, de la moelle épinière et du cortex cérébral, et entraîne des paralysies musculaires. Son incidence est de 1,5/100000 par an, et l’on estime que 4500 personnes sont actuellement touchées. La SLA touche le plus souvent des adultes jeunes vers 55 ans. L’évolution peut être rapidement fatale, en moins de deux ans, ou s’étaler, dans les formes à évolution lente, sur plusieurs années. Il existe des formes familiales (10%) et des formes sporadiques.
En l’absence de traitement étiologique “curatif”, la prise en charge repose sur le traitement des symptômes, la rééducation kinésithérapique et orthophonique dont le principe est d'entretenir les fonctions musculaires restantes, et d’adapter des dysfonctions motrices par des appareillages adaptés au handicap. Seul le riluzole qui réduit la neurotoxicité glutamatergique est susceptible de ralentir l’évolution.
En 2002, la SLA a donné lieu à un appel d’offres de la part du ministère de la santé (Circulaire DHOS/O/DGS/SD 5 D/DGAS n° 2002-229 du 17 avril 2002 relative à l'organisation des soins pour la prise en charge des patients souffrant de sclérose latérale amyotrophique) pour la création de centres de référence dont les missions sont: d’améliorer l'accès au diagnostic et accompagner l'annonce ; de réunir et organiser l'interdisciplinarité nécessaire au suivi de ces situations cliniques complexes et continuellement évolutives ; d’assurer le transfert de connaissances et de savoir-faire auprès des acteurs de proximité et la mise en oeuvre des moyens nécessaires sur le lieu de vie ; de participer à la collecte des données et aux programmes de recherche. C’est dire l’intérêt porté à la mise en commun des compétences.
L’étude des mécanismes moléculaires intervenant dans la mort neuronale, aussi bien sur des neurones que sur des souris transgéniques, a permis à notre équipe de montrer d’une part que l’induction précoce de la forme A du gène nogo pouvait constituer un marqueur diagnostique de la maladie, et d’autre part le rôle primordial du métabolisme énergétique musculaire.
Une connaissance plus précise de ces deux affections à évolution lente particulièrement handicapantes pour les sujets atteints nécessite une étroite collaboration entre chercheurs et cliniciens. Ajouter à la classique confrontation anatomo-clinique une composante “ biologique moléculaire ” fera non seulement évoluer la connaissance des mécanismes moléculaires, mais permettra la mise au point de tests diagnostiques précoces, et ouvrira des perspectives thérapeutiques. Cette collaboration est à la base du projet quadriennal puisque des cliniciens (neurologues et gériatres pour le diagnostic et la sélection de patients), et des anatomopathologistes (pour les banques de tissus) sont partie prenante.
Cette démarche s’inscrit dans l’historique de l’équipe de recherche dont les travaux ont toujours été centrés sur les mécanismes de signalisation intraneuronaux. De la connaissance de plus en plus poussée de ces mécanismes est née l’idée qu’ils participent également aux processus de mort neuronale. Cet intérêt pour les mécanismes de neurodégénérescence, soutenu par l’ULP, a conduit à un rapprochement du laboratoire avec la Faculté de Médecine dans le cadre du développement de recherches associant cliniciens et fondamentalistes. Cette orientation est soutenue par le conseil de faculté, et plus particulièrement par le doyen et par le responsable des projets de recherche.

PROGRAMME DE RECHERCHE
Les travaux actuels des membres de l’EA 3433 visent à élucider les mécanismes cellulaires, communs et/ou spécifiques, des maladies neurodégénératives, et en particulier ceux qui sous-tendent la MA et la SLA. Les stades les plus précoces de ces pathologies sont les plus intéressants à analyser, car l’élucidation des mécanismes à ces stades peut faire espérer un débouché thérapeutique, préventif et peut-être curatif, ou tout au moins de stabilisation. Les démarches expérimentales en cours s’adressent à ces deux pathologies, à la fois pour des raisons de santé publique (cf supra), et parce qu’elles relèvent sans doute, au moins en partie, de mécanismes communs. Cependant, pour des raisons didactiques, c’est successivement que pour chacune de ces pathologies seront exposées les modalités d’étude au sein d’un programme de recherche cohérent et intégré qui aborde : i) les mécanismes cellulaires de la mort neuronale ; ii) les mécanismes spécifiques grâce à des modèles in vivo (animaux transgéniques) ; iii) les corrélats anatomo-biologiques grâce à l’analyse de prélèvements post-mortem (tissus nerveux de patients) et/ou de prélèvements biopsiques (muscle dans le cas de la SLA). Puis seront détaillées les recherches fondamentales in vitro obtenues à partir de “ modèles simplifiés ”, et concernant les mécanismes de la mort neuronale et leurs implications dans les maladies neurodégénératives. Enfin l’intérêt des “ banques de tissus ” sera souligné.

I) ETUDE DES MECANISMES PRECOCES DE LA SLA

A) Les mécanismes de la SLA : données du problème

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective des motoneurones du cortex, du tronc cérébral et de la moelle épinière (Hand and Rouleau, 2002). Elle se traduit par une amyotrophie et une paralysie progressive des motricités volontaires, automatiques et réflexes dues à la perte précoce des neurones du système moteur. La majorité des cas de SLA sont des cas sporadiques mais environ 10% des cas sont des formes familiales à transmission dominante. D’un point de vue clinique, il n’est pas possible de discriminer une SLA familiale d’une SLA sporadique, ce qui suggère des mécanismes communs dans le processus de dégénérescence des motoneurones. Dans environ 20% des cas familiaux, la maladie est liée à la présence d’une mutation dans le gène codant la superoxyde dismutase 1 (SOD1; Rosen et al., 1993), une enzyme de détoxification radicalaire qui protège les cellules contre le stress oxydant. Plus de 80 mutations dominantes différentes du gène codant la SOD1 ont été identifiées et corrélées à l'apparition d'une SLA. L'identification de ces mutations à permis la génération de souris transgéniques exprimant différentes mutations de la SOD1 humaine ou murine (Bruijn et al., 1997; Gurney et al., 1994; Ripps et al., 1995; Wong et al., 1995). L’introduction de cette mutation par transgenèse dans une lignée de souris normales induit chez ces animaux l’apparition de symptômes comparables à ceux qui sont observés dans la SLA (paralysie progressive avec dégénérescence des motoneurones spinaux) dont la gravité est proportionnelle au degré d'expression du transgène. Si la relation entre mutation de la SOD1 et SLA est maintenant clairement établie, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathologie sont en revanche peu documentés. Plusieurs hypothèses ont été émises quant aux moyens par lesquels ces mutations entraînent une modification de l’activité synaptique et conduisent à la dégénérescence neuronale: stress oxydant, facteurs environnementaux, excitotoxicité, anomalie du cytosquelette etc... la diversité des propositions reflète sans doute la complexité des mécanismes mis en jeu. La SOD1 est une enzyme de détoxification des radicaux superoxides et l’implication des formes mutées dans l’apparition de la pathologie tend à appuyer l’hypothèse du stress oxydant comme initiateur des processus dégénératifs.
Un autre point toujours en suspens dans la SLA est l’origine cellulaire de cette maladie. Il est maintenant largement accepté que les motoneurones meurent via des processus apoptotiques impliquant l’activation de caspases (Pasinelli et al., 2000) et la voie mitochondriale (Gonzalez de Aguilar et al., 2000a; Guegan et al., 2001). De plus, il a été montré que l’utilisation d’inhibiteurs de caspases (Li et al., 2000) ou la surexpression de Bcl2 par transgenèse (Vukosavic et al., 1999) ralentissent l’apparition de la pathologie. Cependant, les événements initiant ce processus de mort neuronale sont toujours inconnus : la surexpression ciblée de la SOD1 mutée, soit dans les (Gong et al., 2000), soit dans les motoneurones (Lino et al., 2002; Pramatarova et al., 2001), ne conduit pas au développement de la pathologie. Ces résultats suggèrent donc que l’expression spécifiquement astrocytaire ou neuronale de la SOD1 mutée n’est pas suffisante, à elle seule pour conduire à la mort motoneuronale par apoptose.
Notre hypothèse est que l’expression musculaire de la SOD1 mutée est essentielle à l’initiation de la pathologie.
Plusieurs indices soulignent l’importance de la composante musculaire dans le développement de la maladie. D’un point de vue clinique, l’apparition de la maladie se traduit par un rapide déclin de la force musculaire et une perte massive des mitochondries (Chung and Suh, 2002). Cette dégénérescence mitochondriale est associée à un dysfonctionnement de la chaîne respiratoire des mitochondries au niveau musculaire tant chez les patients (Siciliano et al., 2001) que dans les modèles animaux (Leclerc et al., 2001). De plus il est remarquable que la créatine, substrat du métabolisme énergétique au niveau musculaire ait un effet neuroprotecteur dans la lignée G93A (Klivenyi et al., 1999), et que chez des malades traités à la créatine, les symptômes musculaires soient atténués (Mazzini et al., 2001). On peut donc penser que l’atteinte musculaire primaire est directement liée à un dysfonctionnement mitochondrial.

1°) Résultats préliminaires.
Nos résultats laissent à penser qu’il existe une importante composante musculaire dans le déclenchement de la SLA. Lors d’un criblage différentiel réalisé afin d’identifier les programmes génétiques modifiés précocement dans le modèle G86R de SLAF, nous avons constaté de très importantes modifications du transcriptôme au niveau de la moelle épinière lombaire, bien avant l’apparition des premiers symptômes moteurs. En plus des modifications de nature purement neuronale, comme par exemple la modification de moteurs moléculaires impliqués dans le transport axonal (Dupuis et al., 2000), notre criblage nous a également permis de montrer qu’à un stade asymptomatique, de nombreux processus régulant l’activité cellulaire (propriétés électriques, métabolisme intermédiaire, protéines de la myéline, protéines impliquées dans la croissance axonale…) sont modifiés (Figure 1). Ces modifications ne sont pas spécifiques à la moelle épinière mais se retrouvent également au niveau du muscles gastrocnénien. Parmi les gènes réprimés, nombreux sont ceux impliqués dans la biogenèse mitochondriale et le métabolisme intermédiaire (manuscrit en préparation) et cette répression se retrouve, là encore, au niveau du muscle squelettique, un tissu clé d’un point de vue métabolique. Nous nous sommes donc demandé si la répression de ces gènes pouvait refléter une déficience métabolique plus généralisée et nous avons entrepris une étude sur l’animal entier. Nous avons constaté que les souris SOD1-G86R, bien qu’hyperphagiques, sont plus maigres que les souris contrôles de la même fratrie. Cet hypermétabolisme est dû a une augmentation de la dépense énergétique et contribue à la dégénérescence neuronale puisqu’un régime alimentaire hyperlipidique retarde significativement l’apparition de la maladie et augmente la longévité des souris G86R. Ces résultats appuient eux aussi notre hypothèse concernant l’implication de la composante musculaire dans l’initiation de la pathologie.
Dans ce projet, nous allons explorer cette hypothèse en utilisant des approches complémentaires dans le modèle des G86R et chez les patients SLA afin d’identifier de nouveaux mécanismes et de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de la SLA.



<strong>B) Projet.
1°) Identification de nouvelles cibles pour le diagnostic et le traitement de la SLA : apport des modèles animaux.
La première partie de ce projet à pour objectif d’identifier de nouvelles voies de signalisation impliquées dans la SLA en utilisant les modèles animaux comme point de départ, puis de valider ces résultats dans des biopsies musculaires de patients SLA. Deux approches complémentaires seront utilisées :

- Réalisation de puces à ADN (technologie Affymétrix™) à partir de muscles de souris SOD1 mutée. Cette approche nous permettra d’identifier les gènes spécifiquement régulés chez les souris mutées. Après analyse des résultats, les gènes retenus pour leur potentiel en tant que cible thérapeutique et/ou marqueur diagnostique seront étudiés sur des biopsies musculaires de patients atteints de différentes pathologies neuromusculaires incluant des SLA sporadiques. Ces études nous permettrons donc d’identifier des marqueurs moléculaires spécifiques de la SLA. Ce projet a de fortes implications cliniques puisque ces marqueurs moléculaires devraient permettre de mettre au point de nouveaux outils diagnostiques applicables après des procédures peu invasives (biopsie musculaire). La validation d’un tel diagnostic moléculaire nous permettra de simplifier les essais thérapeutiques en préselectionnant des groupes de patients et en permettant de suivre l’évolution d’une éventuelle thérapie sur un même individu. De plus, cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cellulaires altérés dans la SLA, et, nous l’espérons, de développer des thérapies plus efficaces.

- Afin de vérifier l’importance de l’expression purement musculaire de la SOD1 mutée dans le déclenchement et/ou la progression de la maladie, et de confirmer formellement notre hypothèse, nous sommes en train de générer des souris transgéniques n’exprimant la SOD1G86R que dans le muscle squelettique grâce au promoteur de la créatine kinase musculaire. Si notre hypothèse initiale est correcte, ces souris devraient développer à leur tour une SLA. Cette approche nous permettra de développer un nouvel outil de modèlisation de la SLA et nous ouvrir de nouvelles perspectives quant à la la recherche de nouvelles thérapies et à la prise en charge clinique des patients.


2°) Utilisation de biopsies musculaires pour la recherche de nouvelles cibles pour le diagnostic et le traitement de la SLA.
La seconde partie de ce projet à pour objectif d’étudier, de façon “ extensive ”, le transcriptôme musculaire de patients atteints de SLA en utilisant la même technologie que précédemment (puces à ADN, technologie Affymétrix™). Ce type d’approche a déjà été utilisé avec succès dans d’autres domaines du champ médical, fournissant des outils prometteurs pour le diagnostic et le pronostic de plusieurs maladies.

Cette étude va inclure une série de 20 patients atteints de SLA, recrutés au centre SLA de l’hôpital de la Pitié-Salpêtrière, ainsi que de patients contrôles provenant de chirurgies orthopédiques, et également de patients atteints d’autres pathologies neuromusculaires (voir Dupuis et al., 2002). Les biopsies musculaires non invasives seront réalisées chez les patients sous anesthésie locale à l’hôpital, puis les échantillons nous seront envoyés au laboratoire pour pratiquer les analyses. Les gènes identifiés comme étant régulés chez les patients atteints de SLA seront ensuite étudiés en détail chez la souris G86R par les techniques utilisées en routine au laboratoire (biologie moléculaire, techniques morpho-fonctionnelles, transfection etc…) afin de démontrer la signification fonctionnelle de nos résultats.

Financement : toutes les études décrites dans ce projet sont actuellement financées par des crédits provenants de l’Association Française pour la Recherche sur la SLA et autres maladies du motoneurone, ainsi que par l’ALSA (american ALS association). Des subventions ont également été obtenues auprès de compagnies pharmaceutiques, et nous travaillons actuellemnt au développement de brevets pour de nouveau marqueurs diagnostiques et de cibles thérapeutiques. De plus nous sommes en négociation avec des partenaires industriels pour financer un essai clinique de phase 1/2.
Aspect éthique : Ce projet a déjà été soumis et approuvé par le comité d’éthique de l’hôpital de la pitié Salpêtrière. Le travail sur les souris G86R est actuellement soumis au comité local d’expérimentation animale de Strasbourg.

CONCLUSION : Ce projet a pour but de caractériser en détail les changements précoces du transcriptôme musculaire dans la SLA afin d’identifier de nouveaux marqueurs moléculaires utilisables pour le diagnostic ainsi que des cibles potentielles pour de nouvelles thérapies.